新型長循環脂質體的研制實驗

長循環納米脂質體作為難溶性藥物載體，因具有體內長循環、靶向、保護、高效低毒等特性，極大地解決了脂質體作為納米給藥載體的不足而倍受青睞，是很有發展前景的藥物載體。

長循環納米脂質體又被稱立體穩定脂質體，它是在普通脂質體的基礎上加入一定比例的衍生物，使表面暴露出一些親水性的多糖或多羥基基團等，從而減少了與血漿中的成分結合，增加了脂質體在血液中的穩定性，從而延長了藥物在血液中的作用時間，使藥物有更充足的時間到達靶向部位，增強藥物的治療效果?，F在常用的長循環納米脂質體的修飾物有：神經節苷脂GM1、聚乙二醇(PEG)、非離子表面活性劑及其類脂衍生物等。其中PEG及其類脂衍生物因具有無免疫毒性且來源廣泛等優點，目前已經成為醫學上常用的長循環脂質體表面修飾物，其主要包括PEG-DSPC、PEG-PE、PEG-DSPE、PEG-PC等。被修飾后的脂質體可因PEG分子中大量的親水基團與水結合構成空間位阻，降低吞噬細胞的破壞與吞噬的幾率，延長有效成分在血液中的滯留時間，使其血藥濃度較長時間的作用于靶器官中，使藥物的治療效果明顯提高。長循環納米脂質體存在以下優點：因脂質體的粒徑為納米級別，注射長循環納米脂質體后被包裹的藥物更易透過細胞膜，采用PEG對脂質體進行表面修飾，使脂質體具備長循環和立體穩定結構的特點，對減少肝臟巨噬細胞對藥物的吞噬，維持平穩的血藥濃度，提高藥物靶向性和生物利用度、延長藥物在體內循環時間等具有重要作用和意義。

為了使長循環脂質體制劑更好的應用于工業生產和臨床，國內外學者對脂質體制備工藝的進行了深入的研究，研制出了多種的新型長循環脂質體，包括長循環磁性脂質體、長循環熱敏脂質體、長循環陽離子脂質體、長循環免疫脂質體等。新型長循環脂質體的研制將為復方長循環脂質體的進一步開發提供新的思路與方向。

實驗設備：

Agilent-1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；

CP2250分析天平（奧豪斯國際貿易有限公司）；

RE-52A旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠)；

SHB-Ⅲ真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；

WST-NANO；

高速冷凍離心機（德國Heraeus公司）；

5200H超聲波清洗器（上?？茘u超聲儀器有限公司）；

DF-101B集熱式恒溫磁力攪拌器(浙江省樂清縣樂成電器廠)

實驗步驟與結果：

1三種長循環脂質體制備方法：

為了獲得粒徑較小的納米級的脂質體，本實驗選取了的三種常用制備脂質體的方法并且聯合微射流均質技術進行比較，分別為薄膜分散-微射流均質法、乙醇注入-微射流均質法和逆相蒸發法-微射流均質法，采用3種不同的方法制備蟾酥提取物長循環納米脂質體，通過比較制得的長循環納米脂質體的包封率及粒徑大小對其進行評價。

1.1 薄膜分散-微射流均質法

精密稱取蟾酥提純物5.20mg，成膜材料大豆卵磷脂和膽固醇分別為40mg、10mg，DSPE-mPEG20002mg，溶解于100mL氯仿中，置于減壓旋轉蒸發儀上旋蒸（45℃，100r/min）直至氯仿蒸干。然后加入50mLPBS緩沖液（pH6.8）于圓底燒瓶中進行洗膜，經恒溫水化10min，進行超聲30min，采用genizer微射流均質機對所制備的蟾酥提取物長循環脂質體混懸液進行均質，過0.22μm微孔濾膜整粒，即為蟾酥提取物長循環納米脂質體溶液。

1.2 乙醇注入-微射流均質法

精密稱取蟾酥提純物物5.20mg，成膜材料大豆卵磷脂和膽固醇分別為40mg、10mg，DSPE-mPEG20002mg，溶于100mL乙醇作為有機相，pH6.8的PBS緩沖液作為水相，在1200r·min－1的攪拌轉速下，將有機相勻速緩慢滴入50℃保溫水相中，繼續攪拌2h，揮去乙醇，超聲30min，用genizer微射流均質機對所得混懸液進行均質，過0.22μm微孔濾膜整粒，即得蟾酥提取物長循環納米脂質體混懸液。

1.3 逆向蒸發-微射流均質法

精密稱取蟾酥提純物5.20mg加入到50mLpH7.0的PBS緩沖液，作為水相，精密稱取成膜材料大豆卵磷脂和膽固醇分別為40mg、10mg，DSPE-mPEG20002mg，加入50mL氯仿使其溶解。將水相加入到有機相中，超聲處理5min，得W/O乳劑,置減壓旋轉蒸發器上于恒溫45℃水浴中減壓旋轉蒸發除去氯仿，得稠厚的膠狀物，于干燥箱中室溫條件下放置4h，加入50mLpH6.8的PBS緩沖溶液，洗膜，進行超聲30min，采用genizer微射流均質機對所制備的長循環脂質體混懸液進行均質，過0.22μm微孔濾膜整粒，即得蟾酥提取物長循環納米脂質體混懸液。

結果

1. 長循環脂質體外觀

采用超速離心法測定制備的蟾酥提取物長循環納米脂質體得包封率，14000r/min離心30min，分離游離藥物和含藥脂質體，測定其包封率和粒徑。通過比較所測得的包封率和粒徑大小來選取制備蟾酥提取物長循環納米脂質體方法，具體結果見下表1。

制備方法對長循環納米脂質體包封率和粒徑的影響

從上表中可以看出，由于均采用與微射流均質法聯合應用，三種制備方法所制得的蟾酥長循環納米脂質體的粒徑差別并不明顯，而測得的包封率有較大的差別，采用薄膜分散法制備的長循環納米脂質體的包封率最大，其次是乙醇注入法，而逆向蒸發法最小。三種方法均結合微射流均質法測得的粒徑最小的為薄膜分散法，綜合包封率和粒徑2個評價指標，最終最終選擇薄膜分散—微射流均質法制備蟾酥長循環納米脂質體

長循環脂質體制備工藝單因素考察

本實驗采用薄膜分散—微射流均質法制備蟾酥提取物長循環納米脂質體，以包封率為主要評價指標，以形態外觀為參考，選取有機溶劑的種類、磷脂與膽固醇的比例、藥脂比、DSPE-mPEG2000的用量、水化溫度、超聲時間、微射流壓力作為單因素考察。在單因素試驗的基礎上，選取影響較大的因素作為主要因素，采用星點設計—效應面法對蟾酥提取物長循環納米脂質體的工藝進行優化。本

其中：微射流均質壓力對包封率的影響

固定制備條件：卵磷脂：蟾酥提取物（7:1）；卵磷脂：膽固醇（3:1）；超聲時間40min；水化溫度65℃；加入50mL的氯仿有機溶劑；磷酸鹽緩沖液PH=6.8；加入5%DSPE-mPEG2000；減壓旋蒸溫度43℃。變化條件：微射流壓力，分別為60MPa、80MPa、100MPa、120MPa、140MPa。

方法：采用薄膜分散法制備蟾酥提取物長循環納米脂質體，結合微射流均質法減小其粒徑，測定其包封率，具體結果見下表2。

不同微射流壓力對包封率的影響

實驗結果表明，微射流儀壓力對包封率也存在著影響，當壓力超過100MPa時，脂質體包封率減小，原因可能是過大的壓力導致脂質體破壞，破乳所致，因此本實驗選擇微射流儀壓力為100MPa。

其他單因素檢測細節：略

星點設計優化蟾酥提取物長循環納米脂質體處方與工藝單因素試驗結果表明，超聲時間（X1）、卵磷脂：蟾酥提取物（X2）、卵磷脂：膽固醇（X3）對蟾酥長循環納米脂質體的包封率有較大影響。因此在單因素實驗考察的基礎上，根據星點設計-效應面原理，將較為顯著的3個因素作為自變量，z高水平設定為：X1為50min；X2為9:1；X3為4:1，z低水平設定為：X1為30min；X2為5:1；X3為2:1，以包封率（Y）為因變量，優化蟾酥長循環納米脂質體的處方與工藝。

Box-Behnken試驗結果分析應用DesignExpert8.0軟件對表3-11工藝優化試驗因素水平的試驗結果進行二次多元回歸擬合，得二次多項回歸模型方程Y=86.16－0.33A—1.18B+1.60C－0.42AB+0.55AC+1.38BC－1.50A2－2.09B2－1.50C2，R2=0.9518。模型的R2與1較接近，說明通過二次回歸得到的模型與試驗擬合較好。同時，響應面二次回歸方程方差分析結果顯示：模型F=15.37，P0.05)，不顯著，因此二次模型成立。

影響脂質體包封率的主要因素分析包封率模型(Y)回歸方程的方差分析表明B，C，BC，A2，B2，C2項達極顯著水平(P<0.01)，交互項AB和AC的P分別為0.3189，0.2022，均大于0.05，所以交互項AB和AC對顆粒的一次成型率沒有顯著性影響。通過F值大小可以判斷，選取的3個主要因素對包封率影響大小依次為，磷脂：膽固醇（X3）>磷脂：蟾酥提取物（X2）>超聲時間（X1）

優化處方驗證蟾酥長循環納米脂質體的最佳制備工藝為：

精密稱取蟾酥提取物20mg，大豆卵磷脂140mg，膽固醇40mg，DSPE-mPEG20009mg，溶于100mL氯仿中，于旋轉蒸發儀上減壓旋蒸（43℃，100r/min），有機溶劑氯仿全部除去的同時，燒瓶內壁上會形成一層白色薄膜。此時加入50mLPBS緩沖液（pH6.8）洗膜，再依次經60℃恒溫攪拌水化20min，超聲40min，設定genizer微射流均質機壓力為100MPa，對所得混懸液進行均質，混懸液于14000r/min離心1h，分離游離藥物和含藥脂質體，測定其包封率。根據最佳制備工藝制備三批蟾酥提取物長循環納米脂質體，分別測定華蟾酥毒基與脂蟾毒配基總含量的包封率。具體結果見表3。

工藝驗證結果

討論與小結

脂質體制備方法有多種，實驗中選用薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸發法結合微射流均質法制備蟾酥提取物長循環納米脂質體，以包封率和粒徑作為考察指標，選取理想的制備方法。

實驗結果表明，選取的三種制備方法對粒徑結果影響較小，而對包封率的影響較為明顯。采用薄膜分散法制備的長循環納米脂質體包封率最高，其次是乙醇注入法，z低的是逆向蒸發法，因為此法對水溶性藥物包封率較高，而蟾酥中的華蟾毒配基和脂蟾毒配基于脂溶性成分，因此逆向蒸發法制得的蟾酥提取物長循環納米脂質體的包封率低。且考慮到薄膜分散法工藝簡單，測定包封率較高，因此選用薄膜分散法制備脂質體，但僅使用薄膜分散法制得的長循環納米脂質體粒徑過大，若結合微射流均質法能使脂質體的粒徑減小，有利于均勻分散。因此，最終選擇薄膜分散—微射流均質法制備蟾酥提取物長循環納米脂質體。

本實驗首先進行單因素考察蟾酥提取物長循環納米脂質體的處方與工藝，對有機溶劑種類的選擇、磷脂與膽固醇的比例、藥脂比、超聲時間、水化溫度、DSPE-mPEG2000用量、不同pH值水化介質的選擇、微射流壓力對包封率的影響進行了單因素實驗。實驗結果表明，磷脂與膽固醇的比例、藥脂比、超聲時間對脂質體包封率的影響較大，而水化溫度、DSPE-mPEG2000用量、不同pH值水化介質的選擇、旋蒸溫度對包封率的影響較小，因此選取影響較大的3個因素確定影響范圍，通Box-Behnken響應面法的進行蟾酥提取物長循環納米脂質體工藝優化。

本實驗在單因素考察的基礎上，選用薄膜分散—微射流均質法制備蟾酥提取物長循環納米脂質體，以包封率為主要指標，通過星點設計-響應面法試驗篩選出蟾酥提取物長循環納米脂質體的最佳處方工藝和制備工藝。工藝驗證結果表明：測得包封率和載藥量較高，且粒徑也符合肝靶向要求，說明采用此法制備蟾酥提取物長循環納米脂質體工藝穩定，科學合理。